Jensen nasce il primo marzo 1978 a Dallas, in Texas da Roger Alan, un attore, e Donna Joan Shaffer. Ackles ha un fratello maggiore, Joshua, e una sorella minore, Mackenzie. Ha origini irlandesi, inglesi e scozzesi. I suoi genitori lo hanno chiamato Jensen poiché non è un nome comune. Ackles ha giocato a baseball e lacrosse alle scuole superiori. Voleva studiare medicina dello sport ed intraprendere la carriera di fisioterapista, prima di trasferirsi a Los Angeles e diventare un attore. Dopo aver smesso di fare il modello, nel 1996 Ackles cominciò a concentrarsi sulla carriera di attore. Ha fatto molte comparsate prima di entrare nel cast della soap opera Days Of Our Lives nel ruolo di Eric Brady. Nel 1998 vinse il Soap Opera Digest Award come miglior attore giovane e fu nominato per tre volte (1998, 1999, 2000) ai Daytime Emmy Award come miglior attore giovane in una serie drammatica per il suo ruolo nella soap opera; Jensen vi partecipò comunque saltuariamente dal 1998 al 2000 ovvero per soli 16 episodi. Nel 2000, Ackles lasciò Days of Our Lives, e apparì nella mini-serie Blonde sulla vita di Marilyn Monroe. Fece anche un provino per il ruolo del giovane Clark Kent in Smallville, ma il ruolo venne invece affidato a Tom Welling.
Dopo aver fallito il provino per Smallville, apparse come guest star nella serie televisiva Dark Angel prodotta da James Cameron, sul network Fox nella prima stagione nel ruolo di Ben/X5-493, lo psicopatico, serial killer "fratello" della protagonista Max Jessica Alba. Il suo personaggio morì subito dopo un episodio, ma Ackles fece ritorno nella seconda stagione come fratello gemello di Ben, sotto il nome di Alec/X5-494. Rimase nello show fino alla sua cancellazione, nel 2002, alla fine della seconda stagione. Nel 2003 Ackles entrò nel cast della serie televisiva Dawson's Creek sul network The WB durante la sua ultima stagione interpretando il ruolo di C.J., il ragazzo di Jen Lindley. Dopo girò per il network Fox l'episodio pilota di una serie (Still Life), mai andata in onda.
Ackles tornò sul piccolo schermo nel 2004, come comprimario fisso nella quarta stagione della serie Smallville nel network The WB, interpretando il ruolo di Jason Teague, il fidanzato di Lana Lang (Kristin Kreuk).
Nel 2005 Ackles ha ottenuto il ruolo di uno dei due fratelli protagonisti della serie televisiva Supernatural per il network The CW, dove recita al fianco di Jared Padalecki.
Filmografia
» Wishbone, il cane dei sogni - Michael Duss (1995)
» Settimo cielo - Bambino di Halloween (1996)
» Sweet Valley High - Brad (1996)
» Cybill - David (1997)
» I giorni della nostra vita - Eric Brady (1998 - 2000)
» Blonde - Eddie G. (2001)
» Dark Angel - Ben/X5-493 (2001),
» Dark Angel - Alec/X5-494 (2001 - 2002)
» Dawson's Creek - C.J. (2002 - 2003)
» Still Life - Max Morgan (2003 - 2004)
» The Plight of Clownana - Jensen (2004)
» The Plight of Clownana (2004) (Produttore esecutivo)
» Smallville - Jason Teague (2004 - 2005)
» Devour - Il gioco di Satana - Jake Grey (2005)
» Supernatural - Dean Winchester (2005 - in corso)
» Ten Inch Hero - Priestly (2007)
» My Bloody Valentine 3-D - Tom (2009)